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技術(shù)專欄

Western Blot完全指南：手把手教你避開(kāi)科研深坑！

供稿：市場(chǎng)部

發(fā)布時(shí)間：2025-04-21

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Western Blot完全指南：手把手教你避開(kāi)科研深坑！

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01.Western blot 的起源

1975年，Edwin Southern發(fā)明了DNA雜交檢測(cè)技術(shù)，命名為Southern blot。

1977年，James Alwine、David Kemp和George Stark發(fā)明了RNA雜交檢測(cè)技術(shù)，命名為Northern blot。

1979年，位于美國(guó)斯坦福大學(xué)的George Stark發(fā)明了將蛋白從電泳凝膠上轉(zhuǎn)移到活化纖維素上的技術(shù)，隨后Harry ToWestern blotin發(fā)展出更快速、簡(jiǎn)單的“三明治”結(jié)構(gòu)電轉(zhuǎn)技術(shù)。

1981年Neal Burnette為了方便推廣這一技術(shù)正式將這一技術(shù)命名為“Western blot”

02.Western blot 的用途

①確定目的蛋白的表達(dá)情況

這是Western blot最常規(guī)的應(yīng)用，如檢測(cè)患者的標(biāo)本與正常人的標(biāo)本、實(shí)驗(yàn)條件處理后細(xì)胞與未處理的對(duì)照細(xì)胞之間目的蛋白的表達(dá)變化情況，通過(guò)灰度分析可以確定目的蛋白表達(dá)水平是升高還是降低。

②研究蛋白間的相互作用

這是與免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）技術(shù)相結(jié)合的一種檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的常用方法。通過(guò)CO-IP技術(shù)將相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合體分離出來(lái)后進(jìn)行凝膠電泳，然后利用相互作用的蛋白質(zhì)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。適用于對(duì)已知的蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行檢測(cè)，不適用于檢測(cè)一個(gè)蛋白質(zhì)未知的相互作用蛋白；也可以用于蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用的后續(xù)分析。

③確定目的蛋白的細(xì)胞定位

通過(guò)分別提取細(xì)胞不同部位的蛋白質(zhì)，如膜蛋白、胞漿蛋白核蛋白或線粒體蛋白等，將分離出來(lái)的不同部位的蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot檢測(cè)可以分別檢測(cè)目的蛋白在不同部位的表達(dá)情況。

03.Western blot 的原理

使用 Western blot 可以測(cè)定樣本間的蛋白表達(dá)相對(duì)量，同時(shí)確定靶蛋白的分子量，有助于進(jìn)一步了解翻譯后加工。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，Western blot 共分為 3 個(gè)步驟：(1) 按照分子量大小分離蛋白；(2) 轉(zhuǎn)移到固相載體上；(3) 使用一抗和二抗對(duì)靶蛋白成像。

01.通過(guò)凝膠電泳按照分子量大小分離蛋白。

02.將凝膠緊貼膜放置，同時(shí)施加電流引導(dǎo)蛋白從凝膠遷移到膜上。進(jìn)行免疫染色時(shí)，由于電泳凝膠不利于抗體與其中的蛋白結(jié)合，所以需要進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜。

03.過(guò)靶向目標(biāo)蛋白的特異性抗體進(jìn)一步孵育膜，再通過(guò)二抗和檢測(cè)試劑顯示檢測(cè)信號(hào)。

04.Western blot 抗體選擇

避坑指南：抗體選擇的黃金法則

Western blot 的靈敏度和特異性取決于抗體的質(zhì)量和使用抗體的實(shí)驗(yàn)條件。在使用含有血清和內(nèi)源性免疫球蛋白的組織裂解液或組織培養(yǎng)上清液時(shí)，所選一抗的種屬應(yīng)有別于樣本種屬。例如，如果您研究的是小鼠蛋白，應(yīng)選擇在非小鼠的種屬中培養(yǎng)的一抗（例如在兔中培養(yǎng)的一抗）。這是為了避免免疫球蛋白二抗與樣本中的內(nèi)源性免疫球蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。使用不含內(nèi)源性免疫球蛋白的樣本時(shí)，一抗宿主種屬的選擇相對(duì)沒(méi)那么嚴(yán)格。

為了使蛋白顯色，需要選擇一種可與一抗結(jié)合的（不同于一抗宿主種屬的）二抗。使用酶聯(lián)二抗，例如辣根過(guò)氧化物酶 (HRP) 偶聯(lián)抗體或堿性磷酸酶 (AP) 偶聯(lián)抗體，或者經(jīng)Western blot 優(yōu)化的熒光偶聯(lián)抗體，可以提高靈敏度。記得確認(rèn)偶聯(lián)抗體的光發(fā)射波長(zhǎng)是否與您的讀數(shù)裝置/掃描儀兼容。

與單獨(dú)的一抗相比，偶聯(lián)二抗的靈敏度更高，因?yàn)槎箍梢栽诙鄠€(gè)位點(diǎn)與一抗結(jié)合，從而增強(qiáng)信號(hào)。信號(hào)增強(qiáng)有利于檢測(cè)復(fù)雜蛋白混合物中的目標(biāo)蛋白，所以二抗非常適合用于 Western blot。